ELISA显色步骤中,HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。
1. DAB(3.3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。
2. 5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。
3. OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。
4. OPD(邻苯二胺)形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,可溶性好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色。但具有刺激性和致癌性。
5.
TMB(四甲基联苯胺)。产物为蓝绿色,可溶性好,在酸的作用下颜色转变为黄色。在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度据报道比OPD高4倍以上。
6.
ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体,也是目前用得较广泛和较满意的供氢体。