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免疫电泳

免疫电泳是电泳分析和沉淀反应的结合产物它既加快了沉淀反应的速度又将某些蛋白组分利用其所带电荷的不同而将其分开再分别与抗体反应。免疫电泳的种类很多,常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、交叉免疫电泳、亲和免疫电泳、微量多槽免疫电泳、免疫固定电泳、序贯免疫电泳。

1)对流免疫电泳   自1956 Bussard等人报道该法以来,此法得到广泛的应用。该法的实质是定向加速的免疫双扩散技术。它比琼脂双扩散灵敏度高,检测样品需要的时间短,其基本原理是在琼脂凝胶中打两排孔,左侧各孔加入待测抗原,右侧孔内加入相应的抗体,抗原在阴极端,抗体在阳极端,通电后,处在阳极端的抗体电渗力大于电泳力,而向阴极移动;处阴极端的抗原向阳极移动,当两者相遇之后就会产生肉眼可见的沉淀弧或沉淀线。

2)火箭免疫电泳    1965 Laurel等人首先报道了火箭免疫电泳,它是由单向扩散发展起来的,又称单向电泳扩散免疫沉淀试验。火箭免疫电泳的基本原理是当抗原在电场力的作用下通过含有抗体的琼脂凝胶时,抗原将与相应的抗体发生相互反应形成沉淀弧,而未结合的抗原将继续移动至抗原抗体沉淀弧的先导部分,并溶解复合物再向前移动。直到抗原与抗体反应完毕,便形成状似“火箭”的沉淀峰。当抗体量一定时,沉淀峰的角度是随着质量的增加而增加;当抗原量一定时,沉淀峰的高度是随着抗体量的增加而降低。利用这种关系并以已知量的标准抗原作对照,可以方便的测定未知样本中抗原含量。利用火箭免疫电泳只能定量检测到mg/L以上的含量,低浓度的样品难以形成可见的沉淀峰。在操作时应选择合适的电泳时间,控制低浓度的抗体和适当浓度的抗原,使沉淀峰高达1~5cm,同时应避免边缘效应。

3)微量多槽免疫电泳    这是将琼脂电泳和免疫扩散结合在一起的方法,其程序是将抗原置于琼脂的孔穴中,施加电压后利用其所含电荷和分子量的不同而分离,然后再与电泳方向平行的方向开槽,加入抗体,置于室温下使两者扩散,各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成沉淀弧。每一种抗原组分可形成一个沉淀弧,因此形成沉淀弧的数目就相当于抗原混合物中所含不同组分的数目。根据各蛋白所处的电泳位置,可分为白蛋白区,球蛋白α1区、α2区、β区等。免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响,最主要的是抗原和抗体的比例,其次是抗血清的纯度,以及电泳迁移和双扩散等因素。常见沉淀弧的形状和原因如下所述:①交叉弧,是由两个泳动率和抗原性不同但结构略有差异的组分形成的;②平行弧,是由两个泳动率相同,但抗原性与扩散率不同的组分形成的;③中空弧,沉淀弧中间分开, .但两端仍相连,这是由于抗原过量形成的;④两端分枝弧,是由抗体过量形成的。此外,还有菜盘型弧、扭曲不正弧等。由于形成沉淀弧的影响因素较多,因此对于弧的分析要多积累经验,多分析对比,才能作出恰当的结论。

4)交叉免疫电泳    交叉免疫电泳是利用琼脂凝胶双向电泳测定样品中组分的一种方法,该法经过两次交叉电泳,有较好的分辨率,可用于鉴定样品纯度和定量分析样品组成。其具体操作是先进行第一向电泳将抗原分开,再进行第二向电泳使抗原和抗体发生反应,通过测定沉淀峰所包围的面积并将其同参考抗原形成的相应沉淀面积进行比较,即可对各抗原进行定量分析。该方法适合于含有多种抗原的样品,经过一次交叉免疫电泳后即可得到定量分析结果。