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选购ELISA 试剂盒、抗体与蛋白
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多克隆抗体的制备

1)动物的选择。选择合适的动物是制备抗血清的首要条件。选择时应注意以下几个问题。①抗原与免疫动物的种属差异越远越好,亲缘太近不易产生抗体应答。②抗血清的需求量。从大型动物如马、骡等可获得大量的血清。③抗血清的要求。抗血清可分为R型和H型,其中常用R型。④根据抗原的情况选择。蛋白质抗原适合于大部分动物如山羊和家兔,但某些动物体内含有类似的物质如IgE,多种酶对这些动物的免疫原性极差,免疫后不易出现抗体。⑤甾体激素免疫多用家兔,酶类免疫多用豚鼠。

2)免疫剂量、时间和途径   抗原的剂量选择应考虑抗原性强弱、分子量大小、动物大小、免疫时间等因素。抗原需要量多,时间间隔大,剂量可适当加大。大动物抗原剂量约为0.5~1. 0mg/只,小动物约为0. 1~0. 6mg/只。注射动物时一般采用多点注射,一只动物注射总点数约为8~10点,如足掌、耳后、背部两侧、领下等处皮内或皮下,还可采用肌肉、静脉、腹腔等途径。免疫间隔的时间也很重要。首次免疫后动物机体处于识别抗体和B细胞增殖阶段,如很快接着第二次注入抗原,极易造成免疫抑制。一般首次和第二次间隔10~20d为好,二次以后每次间隔一般为7~10d,不能太长,以免刺激变弱,抗体效价不高。

3)动物采血将动物免疫 3~5次后,若其产生的抗血清鉴定合格,应在免疫后5~7d及时采血,否则抗体浓度会下降。常用的采血方法有:①颈动脉放血法,在动物颈外侧做皮肤切口,找到颈总动脉后剪断血管,放出功脉血; ②心脏采血法,此法多用于豚鼠、鸡等小型动物,采血时应注意穿刺位置; ③静脉多次采血法,家兔可用耳中央静脉,山羊用颈静脉,这种放血法可以隔日一次,多次采血,共可获得1500~ 2000mL血液。

抗血清的分离多采用室温自然凝固,然后放置在37℃或40℃凝块。前者迅速,但血清较少;后者时间长,但血清量多。

                                                       

4)抗体的鉴定    抗血清在保存和使用前,必须做效价和特异性鉴定。

①双向免疫扩散法鉴定抗体的特异性    按双向免疫扩散技术打两排孔,上排放抗原粗提物和纯化抗原,下排放抗血清,进行双扩散18~24h后,仔细观察上下两排孔之间出现的沉淀线。若与粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线,且两者相互融合,则证明该动物已产生单价特异抗体; 不出现沉淀线,表明未免疫成功。若与纯化抗原出现一条沉淀线,而与粗抗原出现多条沉淀线,且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连接,也是成功的免疫,只需将其中的杂抗体除去,即可成为单价特异性抗体。

②双向免疫扩散法测定血清效价    测定抗血清效价有两种稀释方法:一是稀释抗血清,如1:2、1:4、1:8、1:16对倍稀释分别与一个浓度的纯抗原反应另一是稀释抗原,即把抗原做对倍稀释,分别与不同浓度的抗血清进行双扩散实验。效价在1:8以上即可采血用于一般实验。
5)抗体的储存    抗体具有严密的三维结构,使之能够抵御轻度变性的环境,长期存放较为容易。通常将甘油或其他稳定剂加入储存的抗体中。为了防止细菌或真菌污染抗体,可根据需要在抗体中加入抗微生物制剂,如0.02%的叠氮化钠或0.01%的硫柳汞。储存温度可以有三种选择:一是4保存,将抗血清除菌后液体状态放入普通冰箱,可存放三个月到半年以上二是低温保存,即存放于-20-40的低温冰箱,一般可保存5年以上效价不会有明显下降;三是冻干粉状态保存,最后抗体的水分不应高于0.2%,封装后可长期保存5-10年效价不会明显下降。
在保存时应注意抗体溶液不应反复冻融,因为反复冻融会导致部分抗体失活并产生不需要的蛋白-蛋白凝聚物,从而使活性降低甚至丧失。
(6)抗体的纯化    粗制的抗体可用于一般免疫化学试验,但较多情况下应使用纯化后的单价特异性抗体。单价特异性抗体是指抗血清只与其特异性抗原发生反应的抗体。由于抗原的纯度问题,在制备的抗血清中通常会含有其他杂抗体,因此必须除去杂抗体。纯化抗体的方法较多,如亲和色谱法、吸附剂法、离子交换色谱法等。建议采用蛋白A或蛋白G微球纯化法,这种方法效率高。A蛋白或G蛋白基质有商品化的产品,能将任何来源的抗体纯化,而且比常规方法简单,纯化效果是其他常规方法的数倍。