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抗原的制备方法

自然界的许多物质都可以作为抗原但用作诊断试剂的抗原必须是单一特性的即纯化的抗原所以必须将所需的抗原从复杂的组分中提取出来下面介绍一些主要的制备方法

颗粒性抗原的制备

颗粒性抗原主要指细胞抗原或细菌抗原,最常用的细胞抗原是制备溶血素用的绵羊红细胞。它的制备方法比较简单,采集新鲜绵羊红细胞,以无菌盐水洗涤3次,最后配成106/mL浓度的组胞悬液即可细菌抗原多用液体或固体培养物经过集菌后处理制得。有些虫卵、细胞膜成分都可制成颗粒抗原。颗粒抗原呈乳浊液,多采用静脉内免疫法,较少采用佐剂作皮内注射。

 

可溶性抗原的制备和纯化

可溶性抗原主要包括蛋白质、褂蛋白、脂蛋白、细菌毒素、酶、补体等。但是这些蛋白的成分比较复杂,免疫前需要纯化,常用的纯化过程按以下步骤进行。
(1)组织和细胞粗抗原的制备  

将新鲜或超低温保存的样品组织清洗干净后,剪成小块后进行粉碎,常用的粉碎方法有高速组织捣碎机法和研磨法粉碎后的组织匀浆液离心后上清液中就含有可提取可溶性抗原的材料-粗抗原。
(2)组织细胞可溶性抗原的制备 

可用于制备抗原用的细胞包括正常细胞、病理细胞或传代细胞。制备抗原时需将细胞破碎后释放出抗原。制备方法有反复冻融法、冷热交替法、超声破碎法、自溶法、溶菌酶处理法等。
(3)超速离心和梯度密度离心法 

超速离心是分离亚组胞部分及蛋白质大分子的有效手段,它又分为差速离心和梯度离心。离心纯化抗原的方法是依据抗原的比重特点进行分离,目前仅适用于少部分大分子抗原,如1gM、C19、甲状腺蛋白等;对于大量的中、小分子量蛋白质,多不适合用离心的方法进行分离纯化。
(4)选择性沉淀法   

选择性沉淀是采用各种沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀,从而达到纯化的目的,主要包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法、水溶性非离子型聚合物沉淀法等。
(5)亲和色谱、凝胶过滤和离子交换色谱

采用各种色谱手段,可将某种蛋白质从复杂组分中纯化出来。
(6)纯化抗原的鉴定 

常用的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、结晶法、免疫电泳法、免疫双扩散法等。一般常把几种方法联合使用才能判断出可靠的结果。

 

半抗原的制备

半抗原包括多肽、药物、脂肪胺、核苷酸、甾族激素等小分子物质。它们有免疫反应性而无免疫原性,不能诱导抗体产生,只有将它们与蛋白质或其他高分子量物质结合后才能刺激机体产生相应的抗体。常用的结合方法有物理法和化学法。物理法吸附的载体有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等,通过电荷和微孔吸附抗原;化学法是利用化学反应将半抗原和载体交联起来。

常用的载体有蛋白质类如牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白等;多肽类聚合物如多聚赖氨酸;大分子聚合物和某些颗粒如PVP、羧甲基纤维素等。由于半抗原的种类、结合方法、免疫动物类别等的不同,免疫效果也不尽相同。

半抗原与载体交联应掌握以下3个基本原则: ①带有游离氨基或游离羧基,或两种基团都有;②带有羟基、羰基的半抗原,它们不能直接与载体连接,需用化学方法在半抗原上引进羧基才能与载体连接;③芳香族半抗原由于环上带有羧基,它邻位上的氢很活泼、极易取代。所用的双官能团试剂有碳化二亚胺、戊二醛、氯甲酸异丁酯等,这些试剂与抗原的反应在实验室内可以完成,但需要严格控制实验条件。以免抗原失活或载体严重变性

对于某些类固醇和药物其分子结构中无羧基或氨基可采用琥珀酸酐法,0-羟胺法、一氯乙酸钠法、重氮化的对氨基苯甲酸等方法,使之转变为带有羧基或氨基的衍生物,再进一步和载体交联。

 

佐剂
某些物质预先或与抗原同时注入体内可以增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答,这样的辅助剂称为佐剂佐剂本身可以具有免疫原性也可以不具有免疫原性从本质上说它是一种非特异性的免疫增强剂可以增强体内免疫应答与细胞免疫应答
常用的佐剂有生物制剂如百日咳卡介苗结核分枝杆菌、枯草分枝杆菌革兰阴性杆菌等化合物如铝乳磷酸钙、明矾、矿物油、羊毛脂、表面活性剂,聚核苷酸胞苷酸,脂质体等。其中最常用的福氏佐剂是由石蜡油、羊毛脂和卡介苗混合而成它分为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂(不含卡介苗)。
佐剂的作用机理极为复杂主要有:① 改变抗原的物理性状,延缓抗原降解和排除从而更有效地刺激免疫系统刺激单核-吞噬细胞系统增强其处理和递呈抗原的能力③刺激淋巴细胞增殖与分化
佐剂的主要用途有:①增强特异性免疫应答用于预防接种及制备动物抗血清;②作为非特异性免疫增强剂用于抗肿瘤与抗感染的辅助治疗。
福氏佐剂在使用时,应首先和抗原按1:1的比例混合均匀。由于佐剂是油剂,混合的方法有两种:一为研磨法二为搅拌混合法。直到把佐剂和抗原混合均匀成为乳剂才可以进行注射免疫。