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PCR实验步骤

PCR即聚合酶链反应(polymerase chain reactionPCR)不仅是DNA分析最常用的技术,而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

1.      PCR体系中的5个要素: 模板(Template),引物(Primer),酶(polymerase)dNTP,缓冲液(Buffer,含有Mg2+)。现在许多公司已推出酶、dNPTBuffer配成的Mix Buffer,使用更为方便。

2.      20uLPCR反应体系:

模板DNA    2μL

引物1      1μL10100pmol

引物2      1μL10100pmol

dNTP      1.5μL,各200umol/L

MgCl2        2μL

10×buffer    2μL

ddH2O      10μL

Taq      0.5μL2.5U

PCR管中依次加入上述溶液,Taq酶最后加入。 

3.      PCR反应条件:

      预变性:95 3min

      变性:95  45s

      退火:4545s 

      延伸: 72 45s

      延伸完全:5min

      结束:4

      其中变性-延伸过程循环30次。

现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.