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真核表达

真核细胞中蛋白表达比大肠柑橘复杂很多,一般会选择分泌表达载体,以便于蛋白纯化。真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。步骤包括:

1. 克隆目的基因

选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。

2. 重组载体线性化

环状质粒的整合效率十分地,重组载体酶切线性化后整合效率会提高。不同的内切酶线性化会得到不同的转化子。

3. 转化

目前真核细胞的转化方法有很多种,例如锂盐法;PEG法,原生质球法;电穿孔法等。一般会选用原生质球或电击法。

4. 筛选

可先在不含组氨酸的培养基上筛选,然后再PCR筛选。大量转化子的筛选,则可用原为点杂交进行。

5. 鉴定表型和诱导表达

外源蛋白的表达在真核细胞中分两步,即菌体生长和蛋白诱导表达。先在培养基中培养菌体,达到一定的OD值后,诱导表达。