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原核表达

原核表达,是发生在原核生物内的基因表达。 通过基因克隆技术,将外源目的基因,通过构建表达载体并导入菌株,使其特定表达。目前大部分目的基因都是在大肠杆菌中表达的。

原核表达一般程序如下:

获得目的基因: 通过PCR方法,克隆含目的基因的质粒,获得所需基因片段。然后提取mRNA,以mRNA为模板,RT-PCR循环获得产物。

构建重组表达载体:首先将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切,然后回收酶切产物中的载体大片段,在T4 DNA连接酶的作用下连接入载体。

将目的基因插入表达载体中(测序验证):将连接产物转化到E coli DH5α, 然后根据重组载体标志筛选,提取质粒,并进行测序验证。

转化表达宿主菌:

诱导靶蛋白的表达:表达类型有组成型表达,诱导调控型表达,融合表达,分泌表达,可溶性表达。通过菌落SDS-PAGE判断目的蛋白是否大量表达。

表达蛋白分析:检测形成蛋白是包涵体还是可溶性蛋白。

扩增、纯化、进一步检测:纯化整个过程要尽量保持在4度,并根据不同的用途浓缩蛋白。

原核表达系统是目前掌握的最为成熟的表达系统,优点是能在较短时间内获得基因表达产物,并且成本相对低廉。