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碱裂解法提取质粒DNA的基本原理

质粒是一种染色体外的稳定遗传分子,具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。目前质粒DNA提取的方法主要有煮沸法、小量一步提取法、碱裂解法。

其中碱裂解法提取质粒是分子生物实验的常规技术,具体原理是什么呢?

根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。为了方便理解,这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液:

溶液I50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTApH 8.0

溶液II0.2 N NaOH / 1% SDS

溶液III3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。

溶液ITris-Cl是为了控制溶液PH;而EDTA是为了螯合二价金属离子;葡萄糖的作用只是使悬浮的大肠杆菌溶液不会快速沉积到管子底部。

溶液II中用新鲜的0.4 NNaOH2%的SDS等体积混合后使用,用新鲜的浓NaOH稀释制备0.4NNaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。因为NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂。

溶液III其实就是醋酸钾中的钾离子置换了SDS中的钠离子形成不溶的PDS。而高浓度的严,使得沉淀更加完全。而SDS喜欢和蛋白质结合,这样钾钠离子置换的沉淀绝大部分就是蛋白质沉淀,大肠杆菌的基因组DNA一起被共沉淀了。而醋酸就是为了中和NaOH,因为怕会打断DNA,所以要中和了。

剩余的没有沉淀的蛋白质需要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。

影响质粒提取的因素有很多种,如质粒拷贝数、宿主菌株的种类、细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。